ریز آرایه های بایو متریال

ریز آرایه های بایو متریال: غربالگری ریزمقیاس برهم کنش های سلول - پلیمر

شناسایی بیومتریالی که الگوی بیان بهینۀ ژن را القا کرده و سطح مناسب پیوند سلولی را نیز فراهم می کنند، در مهندسی بافت و سلول درمانی از اهمیت بالایی برخوردار است. در اینجا، ما ایجاد ریزآرایه های بیومتریال با سلول - سازگار را بررسی می کنیم که زمینۀ آزمایش ریزمقیاس و سریع برهم کنش های بیومتریال با سلول ها را فراهم می کند. برای اثبات این ادعا، بطور همزمان بیش از 3456 مورد از واکنش های سلول بنیادی مزانشیمی انسانی (hMSC) -  کامپوزیت بیومتریال را مورد بررسی قرار داده و مطالعات مقدماتی در زمینۀ کاربرد این آرایه ها با یک ردۀ سلول بنیادی عصبی (NSC) و کندروسیت های آرتیکولار اولیه تفسیر می کنیم.

سطوحی که سلول ها بر روی آنها رشد می کنند، در کنترل رفتار سلولی نقش کلیدی ایفا می کنند. خواصی همچون زبری سطح، آبگریزی و تعامل خاص با سطح سلول می توانند فعالیت سلول را تحت تأثیر قرار دهند. تعدیل فعالیت سلول نیز ازطریق برهم کنش های بستر میتواند تأثیرات قابل توجهی بر درمان های مبتنی بر بیومتریال داشته باشد. سازه های مهندسی شدۀ بافت، تکثیر سلول های آزمایشگاهی و کپسوله سازی سلول ها همگی برای رشد، عملکرد و یا تحویل به نوعی از تعامل بین سلول ها و مواد پشتیبانی کننده نیاز دارند. تعدیل فعالیت زیستی ازطریق طراحی نسبی بیومتریال بطور گسترده بررسی شده است. یکی از نمونه ها شامل هیدروژل هایی می شود که می توانند رشد سلولی را ازطریق ترکیب لیگاندهای چسبنده تقویت کنند. کنترل عملکرد سلولی بر پایۀ مواد بعنوان ابزاری با قدرت بالقوه برای کنترل سلول های بنیادی مطرح است که قابلیت تمایز به بافت های مختلف را دارند. برای مثال اخیرآ یک بیومتریال خود مونتاژ با پایۀ پپتید مورد بررسی قرار گرفته است که می تواند تمایز پروژنیتورهای عصبی را بطور خاص هدایت کند. در حال حاضر بسیاری از تحقیقات بر تولید مواد زیست فعال ازطریق ترکیب لیگاندها، کپسوله سازی DNA و فاکتورهای رشد متمرکز هستند. بطور کلی، تولید بیومتریال جدید یک فرایند تکراری بوده است: پلیمرها بطور نسبی طراحی شده و سپس بصورت جداگانه ازلحاظ خواص مورد بررسی قرار گرفتند. اخیرآ علاوه بر توسعۀ کتابخانه های متنوع از بیومتریال پلیمری، توسعۀ رویکردهای موازی و ترکیبی نیز بیشتر مورد توجه هستند. پیش از این، یک پلتفرم را تفسیر کردیم که سنتز مقیاس نانولیتر و غربالگری سلول محور در هزاران بیومتریال ریزآرایه را با استفاده از سلول های بنیادی جنینی انسان امکان پذیر می کند. فرایند غربالگری با کمک این فناوری تسریع می شود اما لازم است که مواد بر آرایه در قطرات نانولیتر سنتز شوند. در اینجا، فرایند توسعۀ سیستمی را توصیف می کنیم که با گسترش این فناوری اجازه می دهد تا با بازده بالا از پلیمرهای سنتز شده در ریزآرایه ها استفاده شود. برای اثبات این ادعا، آرایه ای از ترکیبات پلیمرهای زیست تجزیه پذیر با هدف بررسی قابلیت این سیستم در غربالگری مؤثر بیومتریال با طیف وسیعی از سلول های مختلف آزمایش شده است.

نتیجه گیری

برای فراهم نمودن فرصت تجزیه و تحلیل توان بالای بیومتریال ها، یک ریزآرایه پلیمری ایجاد کردیم که امکان آزمایش همزمان کتابخانه های برهم کنش سلول- بیومتریال را با استفاده از فناوری متداول خوانش آرایۀ فلورسنت را فراهم می کند. بیومتریال آزمایش شده از بین پلی استرهای بسیاری (و یک انهیدرید) انتخاب شده اند که بیانگر برخی از رایج ترین بیومتریال پزشکی هستند. بویژه اینکه تصمیم گرفتیم تفاوت بین اشکال مختلف پلی (لاکتید- کو- گلیکولید) (PLGA) را بررسی کنیم که اغلب در مهندسی بافت و دارورسانی کاربرد دارد و همچنین یکی از معدود بیومتریال زیست تجزیه پذیر است که برای کاربرد بالینی تأیید شده است. برای آزمایش اثرات سلولی مخلوط های مختلف در این پلیمرها؛ 24 پلیمر با ترکیب مختلف و وزن مولکولی در 10 درصد وزن/ ولت در DMF حل شده و بصورت جفت برای 1152 ترکیب مختلف در نسبت های 70:30 و 90:10 مخلوط می شوند. با کمک سیستم کنترل آرایه پین اصلاح شده، ترکیبات مختلفی از این مخلوط های پلیمری را بصورت سه تایی روی یک لایه از پلی (هیدروکسی اتیل متاکریلات) (pHEMA) و بالای یک اسلاید با روکش اپوکس رسوب می کنیم. pHEMA از رشد سلول جلوگیری می کند؛ با این وجود، استدلال ما این است که رسوب پلیمرها بر روی سطح pHEMA می تواند به داخل نفوذ کرده و بطور بالقوه با حذف محلول، ثابت بماند. علاوه براین، pHEMA از رشد سلول در فضاهای بین پلیمرهای مختلف جلوگیری می کند؛ در نتیجه، اجازه می دهد تا اثرات مواد بر روی سلول ها از مواد مجاور مستقل باشد. باتوجه به شکل زیر، حلال پس از رسوب به سرعت تبخیر شده و لکه های پلیمری سفت و سختی ایجاد می کند که به طور کلی به اسلاید متصل می شوند.

شکل 1: میکروسکوپی ریزآرایه های بیومتریال

برای افزایش ضخامت، شش لایه از پلیمر در هر نقطه قرار داده شد. پس از خشک شدن، پلیمرها روی سطح pHEMA لکه های پلیمری دایره ای شکل اما نامنظم ایجاد کردند. این لکه های پلیمری بطور کاملآ مستقل از ترکیب پلیمر به ریزآرایه متصل می شوند؛ به این ترتیب، امکان آزمایش مواد در محیط آبی مورد نیاز برای آزمایشات سلول محور فراهم می کنند. رسوب پلیمرهای تشکیل شده بصورت آرایه ای روی یک اسلاید شیشۀ معمولی 75×25 میلیمتر امکان لکه شدن همزمان و تصویربرداری فلورسنت چهار رنگِ چندین اسلاید را فراهم می کند که هرکدام حاوی 3456 لکۀ پلیمر منفرد هستند. 20 آرایۀ پلیمری 3456 نقطه ای را میتوان در یک روز ساخت. برای اثبات این ادعا، تأثیرات ریزآرایه های بیومتریال با 3456 لکه بر سلول های hMSC را بررسی کردیم. یک میلیون سلول بر روی ریزآرایۀ پلیمری کشت شدند. بعد از 48 ساعت، آرایه با استفاده از فالوئیدین الکسا 488 که یک لکۀ فلورسنت سبز مختص به اکتین -F است، رنگ آمیزی شد. در کل، سلول ها به اکثر این مواد متصل شده و گسترش می یابند؛ بطور متوسط تقریبآ 60 سلول در هر نقطه. با این حال، برخی از ترکیبات پلیمری بطور واضح از اتصال سلولی جلوگیری می کنند. بطور کلی باتوجه به جدول زیر، پلیمر با پلیمر 21به عنوان مهارکنندۀ اتصال سلولی مخلوط می شود.

جدول 1: طراحی ریزآرایۀ بیومتریال

پلیمر 21 حاوی پلی اتیلن گلیکول (PEG) است که در دیگر زمینه ها برای مهار کردن اتصال سلولی نشان داده شده است. نکتۀ جالب اینجاست که با افزودن تنها 30 درصد از پلیمر 17، میتوان به رشد دوباره دست یافت. پلیمر 17 همان PLGA با 70 درصد لاکتید -L  است و بنابراین درمقایسه با دیگر پلیمرهای آزمایش شدۀ PLGA قابلیت بالایی در تبلور دارد. این پلیمرهای آزمایش شده ممکن است به جدایی بالقوۀ فاز بین نقاط غنی از PEG و لاکتید - L منجر شود. کاربرد پلیمرهای ریزآرایه ای با دیگر سلولها با استفاده از آرایه های کوچک PLGA مورد بررسی قرار گرفت. لکه های پلیمر با 1000000 کندروسیت آرتیکولار اولیه کشت شدند؛ بعد از 48 ساعت، لکه گیری و رنگ آمیزی شدند. کندروسیت ها با متوسط 200 سلول در هر لکه، قادر به اتصال به حفره های کاملآ بستۀ سلول بودند. کلاژن ΙΙ یک شاخص اصلی برای عملکرد طبیعی کندروسیت ها محسوب می شود که معمولآ پس از جداسازی به دیگر سلول ها مانند فیبروبلاست ها بسیار زیاد بیان می شود. برای مقایسه، این آرایه های کوچک با 1000000 سلول بنیادی عصبی کشت شدند. بعد از 48 ساعت رشد، برای پروتئین اسیدی گلیال فیبریلاری بعنوان یک نشانگر معمولی برای بیان تمایز استروسیت ها رنگ آمیزی شدند. مجددآ این سلول ها بصورت تک لایه ای برای اتصال به لکه های پلیمر ایجاد شده و با متوسط 120 سلول در هر لکه برای GFAP رنگ آمیزی شدند. این آزمایشات اولیه پتانسیل ریزآرایه های پلیمری را برای ارزیابی اثرات مواد بر رشد و تمایز سلول های بنیادی غضروفی و عصبی نشان می دهد.

یک سیستم ریزآرایه پلیمری ایجاد کردیم که امکان غربالگری سریع کتابخانه های بزرگ پلیمرها با هدف بررسی اثربخشی آنها بر سلول ها را فراهم می کند. پیش از این، سنتز آرایه ای و غربالگری ریزآرایه های پلیمری را تفسیر کردیم. این ریزآرایه های تفسیر شده در اینجا با ایجاد امکان غربالگری با بازده بالا از مواد سنتز شده و تصفیه شده با کمک روش های متداول میتوانند این فرایند را گسترش دهند. ریزآرایه ها می توانند به سرعت شناسایی شوند و همچنین کتابخانه های دارای 1000 عضو نیز می توانند ازلحاظ اثربخشی شان بر رفتار سلول و بیان ژل بررسی شوند. برای اثبات این ادعا، یک ریزآرایه پلیمری با کتابخانه ای از پلی استرها ایجاد کرده و قابلیت این کتابخانه را برای پشتیبانی از اتصال و گسترش سلول های hMSC بررسی کردیم. نتایج حاصله کاربرد بالقوۀ این ریزآرایه ها را در غربالگری پلیمرها با اثرات کنترل بیان و تمایز ژن نشان می دهد. علاوه براین، شناسایی موادی که می توانند تمایز سلول های بنیادی عصبی را کنترل کنند، میتوانند در ساخت سازه های مهندسی بافت عصبی نیز مفید باشند. ساخت این ریزآرایه ها با استفاده از یا اسلاید شیشه ای معمولی، امکان رنگ آمیزی سریع در چندین نشانگر با کمک تجهیزات استاندارد ایمونوهیستوشیمی را فراهم می کند. پس از رنگ آمیزی، خوانش را میتوان با ریزآرایه معمولی و یا درصورت لزوم با کمک اتولودر اسلایدی انجام داد. در آینده، با امید به شناسایی پلیمرهایی که می توانند سطوح جدیدی از کنترل بر رفتار سلول ها را فراهم کنند، کتابخانه های بزرگتری از بیومتریال پلیمری مورد بررسی و آزمایش قرار می گیرند. در حالی که تمام این آزمایشات اولیه شامل کاربرد آنها با سلول ها نیز می شوند، این فناوری ممکن است برای غربالگری برهم کنش های بیومتریال با دیگر مواد مانند پروتئین ها (برای مثال غربالگری پلیمرها برای مقاومت در برابر سوخت زیستی) مفید باشد. بطور کلی، قابلیت ایجاد آرایه های بزرگ و کوچک پلیمری در سیستم فلورسنت سازگار ممکن است برای شناسایی و خواص بیومتریال مفید باشد.