دی پلیمریزاسیون سریع بطری PETبا واسطه پیش تصفیه میکروویو و PETase مهندسی شده
بازیافت پلاستیک کلید رسیدن به اقتصاد پایدار است. تجزیه بیوکاتالیستی پلاستیک‌ها امکان دی پلیمریزاسیون انتخابی مواد ساخت دست بشر را برای جایگزینی بلوک‌های ساختمانی در محیط‌های آبی ملایم فراهم می‌کند. با این حال، پلاستیک‌های نامحلول دارای زنجیره‌های پلیمری هستند که می‌توانند در ترکیبات مختلف دوام داشته باشند و ساختارهای ثانویه فشرده دسترسی کمتر به واکنش دی پلیمریزاسیون توسط آنزیم‌ها را نشان می‌دهد. در این بررسی، ما سعی کردیم این کاستی‌ها را با کمک اشعه مایکروویو به عنوان یک فرایند پیش تصفیه برای تحویل پودرهای پلی اتیلن ترفتالات (PET) که برای بررسی‌های بیوتکنولوژی به منظور کمک به تجزیه پلاستیک توسط آنزیم‌های مهندسی شدۀ قبلی به حداقل برسانیم. یک مرحله میکروویو بهینه منجر به افزایش 1400 برابری انتگرال ترفتالیک اسید (TPA) آزاد شده از کروماتوگرافی سیال با عملکرد بالا (HPLC)، در مقایسه با بطری PET تصفیه نشده اصلی، می‌شود. هیدرولیز پلاستیک بیوکاتالیستی بسترهای بطری PET به عملکرد 78 درصدی تبدیل از پیش تصفیه ماکروویو 2 ساعته و واکنش آنزیمی 1 ساعته در 30 درجه سانتیگراد پاسخ داد. همچنین افزایش فعالیت ناشی از افزایش دسترسی به بستر از مرحله میکروویو و آنزیم‌های طراح قادر به انطباق الیگومرها و زنجیره‌های کوتاه تر آزاد شده در ترکیب مولد نیز مشاهده شد.
درحال حاضر محصولات پلاستیکی پس از مصرف با انباشته شدن در محیط زیست نزدیک به 400 تن در سال زباله تولید می‌کنند. نیمه عمر برای تجزیه طبیعی پلاستیک‌های رایج مانند پلی اتیلن، پلی پروپیلن، پلی اتیلن ترفتالات (PET) و پلی آمیدها می‌تواند صدها سال باشد. سرعت تجزیه آهسته منجر به تشکیل ذرات پلاستیکی میکروسکوپی می‌شود که می‌توانند در محل‌های دفن زباله، رودخانه‌ها و اقیانوس‌ها جمع شده و نه تنها سلامت انسان و دیگر جانداران را به خطر بیندازند، بلکه تهدید جدی برای محیط زیست به شمار روند. درحال حاضر، حدود 90 درصد پلاستیک‌های دور ریخته شده یا سوزانده می‌شوند و یا در محل‌های دفن زباله و دیگر محیط‌های طبیعی در سراسر جهان دفن می‌شوند. تا کنون، بازیافت مکانیکی رایج ترین فرایند بازیافت پلاستیک است اما به تمیز کردن زباله‌های پلاستیکی تک نوع با کیفیت بالا محدود می‌شود. تجزیه بیوکاتالیستی پلاستیک از ویژگی بالای آنزیم‌ها در شرایط واکنش خفیف بهره می‌برد که در آن، یک آنزیم به طور ایده‌آل می‌تواند به طور انتخابی یک نوع پلیمر واحد را از مخلوط‌های کمپلکس مشاهده شده در جریان زباله‌های پلاستیکی تجزیه کند. با این حال، تاریخچه کوتاه پلیمرهای مصنوعی نمی‌تواند زمان کافی برای توسعه بیوکاتالیست‌های کارآمد قادر به تجزیه مواد دست ساز را فراهم کند. ساختار ثانویه قوی پلیمرهای مصنوعی، درجه پلیمریزاسیون و کریستالیته بالای آنها می‌توانند تجزیه بیوکاتالیستی را مسدود کنند. دیگر چالش‌های پیشروی بازیافت آنزیمی پلاستیک شامل نیاز به بیوکاتالیست برای شناسایی بسترهای اقامت در ترکیبات مختلف و انعطاف ناپذیری زنجیره پلیمری می‌شود. الیگومرها که در طی فرایند تجزیه آزاد می‌شوند، ممکن است به ترکیبی از آنزیم‌های ذاتا متفاوت نیاز داشته باشند. درمورد دی پلیمریزاسیون کاتالیز آنزیمی PET، زنجیره‌های پلیمری ابتدا مورد حمله PETase (پلی استراز) قرار می‌گیرند و به دنبال آن MHETase به واسطه‌های 2-هیدروکسی اتیل ترفتالیک اسید (MHET) و بیس (2-هیدروکسی اتیل) ترفتالات (BHET) به اسید ترفتالیک (TPA) تبدیل می‌شوند. I.sakaiensis PETase (IsPETase که در اینجا WT گفته می‌شود) در سال 2016 کشف شده و ازنظر تکاملی به کوتینازها مرتبط شد. IsPETase قابلیت تجزیه نیمه کریستالی PET را دارد و به بیوکاتالیست آزمایشگاهی و میکروبی توسعه یافته است. با این حال، IsPETase ناپایدار است و در دمای بالاتر از 40 درجه سانتیگراد دناتوره می‌شود. از IsPETase برای بازیافت مقیاس صنعتی PET استفاده نمی‌شود.
برای افزایش سرعت دی پلیمریزاسیون کاتالیز شده آنزیم، کیمارا های چند آنزیمی قبلاً برای تغییر پلیمر به بلوک‌های سازه‌ای مونومر کشف شدند. مهندسی بیوکاتالیست اساسا بر روی افزایش پایداری حرارتی متمرکز شده که منجر به حفظ عملکرد در دمای واکنش بالاتر، نزدیکتر یا فراتر از دمای انتقال شیشه در پلیمر می شود. استفاده از تکنیک‌های مهندسی آنزیم نسبی برای بهبود پایداری IsPETase و عملکرد کاتالیزوری باعث پایداری حرارتی در ThermoPETase و DuraPETase می‌شود.
ThermoPETase که توسط سان و همکارانش توسعه یافت، در دمای 40 درجه سانتیگراد در مقایسه با IsPETase 14 برابر بیشتر بود. همچنین بهبود قابل ملاحظه‌ای در پایداری آنزیم تا 10 روز همراه با افزایش 9 درجه سانتیگراد در Tm مشاهده شد. توسعه یافته است. DuraPETase که توسط کویی و همکارانش توسعه یافت، پایداری حرارتی (80 درجه) را بهبود داده و 30 درصد از فیلم PET را در دمای 40 درجه طی بیش از 10 روز را تبدیل کرد. در سال 2018، با ارائه گزارشی از کوتیناز کمپوست شاخه و برگ مهندسی شده (LCC) که در بازیافت بطری‌های PET در دمای 72 درجه‌ای تا 90 درصد به دست آمد، پیشرفت قابل توجهی در تجزیه PET حاصل شد. همچنین گزارش شد که استفاده از این LCC برای بازیافت زیستی 1 تن PET، در مقایسه با هزینه 250 یورویی فرایند مکانیکی، تنها 63 یورو هزینه دارد. به تازگی، تکامل هدایت شده به عنوان تکنیکی برای مهندسی بیشتر داربست ThermoPETase استفاده شده که منجر به یک بیوکاتالیست مشتق شده از IsPETase به نام HotPETase شد که افزایش 25 درجه‌ای در دمای ذوب را نشان داد.
همان طور که در شکل زیر آمده است، مهندسی آنزیم منجر به پیشرفت‌های چشمگیری در دی پلیمریزاسیون بیوکاتالیستی پلی اتیلن ترفتالات (PET) شده است.
شکل 1:
با این حال، ضرورت پیش تصفیه مواد برای دستیابی به دی پلیمریزاسیون پلاستیک بیوکاتالیستی بالاتر تایید شده است. در روش‌های فراتر از آمورفیزاسیون ساده امکان بررسی انطباق بستر و دسترسی وجود ندارد. در اینجا، ما بر درک فاکتورهای مهم ساختارهای آنزیمی و مواد به منظور فعال کردن هیدرولیز متمرکز شدیم. همچنین مرحله پیش تصفیه را نیز مدنظر داریم که می‌تواند با کمک آنزیم انتخاب شده تجزیه پذیری مواد پلاستیکی را افزایش دهد. مراحل پیش تصفیه که کاربرد گسترده‌ای در تبدیل زیست توده دارند، ساختار شیمیایی را تحت تاثیر قرار داده و مواد سمی را از واکنش آنزیم حذف می‌کند. علاوه براین، طول زنجیره پلیمری را کوتاه می‌کند. روش پیش تصفیه میکروویو به عنوان یک رویکرد شیمی سبز در زیست توده لیگنوسلولزی مورد توجه قرار گرفته و در دی پلیمریزاسیون PET با کاتالیزور مایع یونی مبتنی بر آهن دو هسته‌ای استفاده شد. ما این فناوری را به بازیافت پلاستیک بیوکاتالیستی منتقل کرده و پتانسیل آن و بررسی واسطه‌های تشکیل شده توسط NMR را نیز بیان کردیم. همانطور که انتظار می‌رود، درجه پلیمریزاسیون (DP) بطری PET در پیش تصفیه میکروویو به عنوان تابعی از زمان تصفیه کاهش یافت. به علاوه، به این نتیجه رسیدیم که ترکیب غالب مواد پس از پیش تصفیه نسبتا طولانی در مقایسه با ساختارهای ترنس-گاوش مخلوط که در بطری PET همزیست هستند، ترنس است. ترکیبی از انطباق مطلوب و درجه پلیمریزاسیون پایین تر برای مواد پیش تصفیه شده به وضوح دسترسی به آنزیم را افزایش می‌دهد؛ به ویژه اگر زنجیره‌ها ترتیب کریستالی نداشته باشند. یافته های ما بیانگر ضرورت پیش تصفیه را قبل از بازیافت بیوکاتالیستی پلیمرهای مصنوعی به منظور تطبیق ترکیبات آنزیم و بستر هستند. به پیشرفت‌های قابل توجهی در گونه I. sakaiensis polyesterase (IsPETase) S238 A ، با تقدم PET ترنس، دست یافتیم که در 2 h-mPET تقویت شد. به طور خلاصه، ما با کمک ترکیب بیوتکنولوژی با شیمی فیزیکی و مهندسی پروتئین، یک بطری PET را با افزودن 2 میلی گرم آنزیم در هر گرم 2 h-mPET در دمای محیط (30 درجه) به مدت یک ساعت به مونومر 70 درصد (واکنش در مقیاس 1 گرم) تبدیل کردیم. نرخ تبدیل در اینجا در دمای محیط با کارهای قبلی منتشر شده توسط تورنیر و همکارانش که نتیجه 9 درصدی از تبدیل بطری PET در 70 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت داشتند، قابل مقایسه است. روش پیش تصفیه میکروویو یک تکنیک امیدوارکننده برای تسریع بازیافت پلاستیک بیوکاتالیستی است.
