مهندسی ورق سلولی

مهندسی ورق سلولی

ما "مهندسی ورق سلولی" را با هدف جلوگیری از محدودیت های بازسازی بافت با استفاده از داربست های زیست تخریب یا تزریق سوسپانسیون تک سلولی توسعه داده ایم؛ مفهوم ما بازسازی بافت است، نه از سلول های منفرد بلکه از ورق های سلولی. ورق های سلولی با استفاده از ظروف کشت واکنش پذیر به دما تهیه میشوند. پلیمرهای پاسخ دهنده به دما بصورت کووالانسی بر روی ظروف پیوند میخورند و به سلول های مختلف اجازه میدهند در دمای 37 درجه سانتیگراد چسبیده و تکثیر یابند. در صورتی که دما به زیر 32 درجه سانتیگراد کاهش یابد، سلول ها خود به خود بدون نیاز به آنزیم های پروتئولیتیک جدا میشوند. سلول های همریز بطور غیرتهاجمی بصورت ورق های سلول منفرد و مجزا با اتصالات سلول - سلول و ماتریکس خارج سلولی  (ECM)رسوب شده برداشت میشوند. ما از این صفحات سلول های برداشت شده برای بازسازی های مختلف بافت من جمله سطوح چشمی، رباط های پریودنتال، تکه های قلبی و بزرگ شدن مثانه استفاده کردیم. در قرن 21، درمان های مدرنی ابداع خواهد شد. دارورسانی کنترل شده قبلآ برای مصارف محدود تجاری شده است؛ ژن درمانی نیز در بیماران انسانی بطور تجربی درحال بررسی است. علاوه براین، سیستم های جراحی رباتیک و همچنین سیستم های ناوبری (نویگیشن) جراحی با کمک رایانه بصورت تجاری در دسترس هستند. مهندسی بافت برای اولین بار در دهه 1980 توسط یک شیمی دان R. Langer و یک جراح J. P. Vacanti ارائه شد. فناوری مهم همان استفاده از داربست های پلیمری زیست تخریب است که از قبل در بافت هدف برای بذر سلول شکل گرفته است؛ همانطور که در بازسازی بافت های عضروف برای رشد گوش انسان بر روی موش ها نشان داده شده است. با ترکیب داربست های پلیمری زیست تخریب و انواع خاصی از سلول ها، بافت های مختلف همچون غضروف، استخوان و رگ های خونی بازسازی شده اند؛ اگرچه تاکنون استفاده درمانی بسیار محدود بوده است. پس از پیوند ساختارهای مهندسی بافت به میزبان، داربست ها طی هفته ها یا ماه ها تخریب میشوند. فضایی که قبلآ توسط داربست اشغال شده بود با سلول های تکثیر یافته / رسوب یافته ECM همچون کلاژن پر میشود. با این حال، رسوب ECM در بافت ها اغلب به فیبروز، که یک وضعیت پاتولوژیک است، منجر میشود. علاوه براین، خواص مختلف این نوع داربست میتواند در برخی از بافت ها نامطلوب باشد؛ بعنوان مثال، کدورت و انعطاف پذیری داربست های پلیمری به ترتیب ناگزیر از بازسازی بافت آفتالمولوژی و قلبی است. با پیشرفت سریع در درک زیست شناسی سلولی مولکولی بنیادی در دهه 1990، استفاده بالینی از سلول های بنیادی امیدوارکننده به نظر می رسد. اخیرآ، روش های درمانی جدیدی با استفاده از مهندسی بافت و فناوری سلول های بنیادی که اصطلاحآ پزشکی ترمیمی نامیده میشود، بررسی شده است. در پیوند آزمایشی به حیوانات کوچک مانند موش و موش صحرایی، اغلب تزریق سوسپانسیون های تک سلولی گاهی اثرگذار است. با این حال، نه نظر نمی رسد این تزریق برای بازسازی بافت های بزرگ مناسب باشد؛ زیرا فقط چند درصد از سلول های تزریق شده در بافت های میزبان ادغام شده اند. بدیهی است که درحال حاضر فاقد روش های موفق در بازسازی بافت هستیم. به همین دلیل است که "مهندسی ورق سلول" را پیشنهاد می کنیم. از آنجا که پلیمرهای زیست تخریب پذیر بعنوان فناوری کلیدی در مهندسی بافت نسل اول محسوب میشوند، ما درحال ساخت ظروف کشت واکنش پذیر به دما برای نسل بعدی هستیم.

 

ظروف کشت واکنش پذیر به دما

از لحاظ بافت شناسی، پارانشیم (خواص بافتی یک اندام) شامل صفحات سلولی مرتبط با هم است. برای مثال، کبد شامل ورق های هپاتوسیت ها و سلول های اندوتلیال میشود که بصورت به هم پیوسته یک شبکه سه بعدی از بافت مداوم را تشکیل می دهند. ارتباط بین چندین نوع ورق سلولی در عملکردهای بافتی که در شرایط پاتوبیولوژیک آسیب دیده اند بسیار ضروری است. چنین مشاهداتی توسط زیست شناسی تکاملی نیز پشتیبانی میشود زیرا هر اندامی از سه ورق سلول متفاوت به نام های آندودرم، مزودرم و اکتودرم نشأت می گیرد. ورق های سلولی در تکامل با اندام ها با یکدیگر در تعامل هستند. بنابراین میتوان گفت که این ملاحظات ما را تشویق کرده است تا بازسازی بافت را بر پایه ورق سلولی آغاز کنیم. سلول ها معمولآ با استفاده از آنزیم های پروتئولیتیک مانند تریپسین و دیسپاز برداشت میشوند. این آنزیم ها مولکول های چسبندگی سلول و ECM رسوب شده را برای جدا کردن سلول های کشت تخریب می کنند. اما در عین حال، پروتئین های اتصال سلول - سلول و همچنین پروتئین های گیرندۀ بیان شده در غشای سلول اغلب آسیب می بینند. بنابراین، برداشت ورق های سلول کشت شده فقط با سلول های خاصی حاصل میشود که اتصالات سلول - سلول کمتر به چنین آنزیم هایی حساس هستند. به همین منظور، ما ابتدا ظروف کشت واکنش پذیر به دما را توسعه دادیم. پلیمر پاسخگو به دما، پلی (-Nایزوپروپیل اکریلامید)، بصورت کووالانسی بر روی سطح ظروف کشت پیوند می خورد. براساس شکل زیر، یک لایه پلیمر پیوندی با ضخامت تقریبآ 20 نانومتر امکان کنترل چسبندگی/ جدا شدن سلول واکنش پذیر به دما را فراهم می کند.

 

شکل 1: تصاویر میکروسکوپی نیروی اتمی از سطوح ظروف کشت پاسخگوی حرارتی

 

 

در دمای 37 درجه سانتیگراد، همانند ظروف کشت بافت موجود در بازار، سطح آن نسبتآ آبگریز است اما در زیر 32 درجه سانتیگراد آبدوست است. انواع مختلفی از سلول ها در دمای 37 درجه روی سطح می چسبند، گسترش می یابند و حتی تکثیر می یابند. با کاهش دما به زیر 32 درجه ، سلول ها بدون نیاز به تریپسین خود به خود از سطح بالا می روند. سلول های بسیار حساس به تریپسین مانند هپاتوسیت ها و سلول های گلیال عملکرد سلول های محلی متمایز خود را پس از برداشت سلول غیرتهاجمی حفظ می کنند. همانطور که در شکل زیر بیان شده است، سلول های متراکم بصورت ورق سلولی مجاور منفرد با اتصالات سلول - سلول و ECM رسوب شده بهبود یافتند.

 

شکل 2: برداشت ورق سلول

 

 

ورق های سلولی قابل برداشت و قابل رویش را میتوان در شرایط آزمایشگاهی یا سطوح بافت در داخل بدن انتقال داد؛ که ما آن را دستکاری ورق سلول دو بعدی می نامیم. از آنجا که ECM مرتبط با سمت پایه ورق های سلول میزان چسبندگی را نشان می دهد، میتوان ورق های سلول برداشت شده را برای بازسازی ساختارهای بافت ضخیم تر یا پیچیده تر همانند عضله قلب، لوب کبد و گلومرول کلیه (دستکاری ورق سلول سه بعدی) طبقه بندی کرد.

 

بازسازی سطح چشم

در اولین کاربرد بالینی ما از ورق های سلول برداشت شده از ظروف کشت پاسخگو حرارتی، از ورق های سلول اپیدرمی استفاده می کنیم. این ورق های سلولی انسانی که با استفاده از ظروف کشت پاسخگو حرارتی تهیه می شوند، شکننده نیستند و درمقایسه با ورق های سلول برداشت شده مشابه با درمان معمول دیسپاس، چسبندگی بهتری روی سطح  زخم نشان می دهند. ایمونوبلات نشان می دهد که دیسپاس پروتئین های اتصال سلول - سلول را تخریب می کند اما این پروتئین ها در روش برداشت ما همچنان دست نخورده باقی می مانند. ورق های سلول غیرتهاجمی برداشت شده و پیوند شده با استفاده از سطوح کشت واکنش پذیر به دما همچنین برای بازسازی سطح چشم استفاده شده اند. علاوه براین، مشخص شده است که سلول های بنیادی اپیتلیال قرنیه در لیمبوس، نقطه مرزی بین قرنیه و ملتحمه، قرار دارند. تروما چشمی مانند سوختگی های قلیایی و بیماری های شدید چشمی من جمله سندرم استیونز - جانسون و پمفیگوئید چشم باعث تار شدن قرنیه و از دست دادن بینایی به دلیل کمبود سلول های بنیادی لیمبال میشوند. اگرچه در این موارد پیوند قرنیه لازم است، اما تعداد اهداء کنندگان در ژاپن و برخی کشورهای اروپایی بسیار محدود است. براساس شکل زیر، سلول های بنیادی اندام برای درمان این بیماران جدا شده و در ظروف کشت پاسخگو حرارتی در دمای 37 درجه سانتیگراد گسترش یافتند.

 

شکل 3: پیوند ورق سلولی اپیتلیال قرنیه

 

 

ورق های سلول اپیتلیال چندلایۀ قرنیه صرفآ با کاهش دما تا 20 درجه سانتیگراد بدون استفاده از پروتئازها کاملآ دست نخورده برداشت میشوند. اتصالات سلول - سلول و ECM در قسمت پایه ورق که برای یکپارچگی و عملکرد ورق بسیار مهم است، سالم باقی می مانند. با استفاده از روش تشکیل کلنی، جمعیت مناسبی از سلول های پیش ساز قرنیه که ازلحاظ تعداد نزدیک به بذر اصلی است، در ورق ها یافت میشود. ورق های برداشت شده به راحتی دستکاری میشوند؛ شکننده تر هستند؛ بدون هیچ گونه حاملی قابل پیوند بوده و به راحتی به استرومای قرنیه می چسبند تا نیازی به بخیه زدن نباشد. همانطور که در شکل زیر بیان شده است، بهبود چشمگیر بینایی را میتوان در همه موارد مشاهده کرد.

 

شکل 4: بازسازی قرنیه

 

 

براساس یافته های ما، نمونه برداری از بافت اندام 2 میلیمتر در 2 میلیمتر برای یک گیرنده کافی است؛ و اینکه بیش از 20 بیمار میتوانند با استفاده از سلول های بنیادی تهیه شده از یک چشم اهداء شده با ورق های سلول اپیتلیال قر نیه پیوند شوند. همچنین ما درحال کار با پیوند ورق سلول های اندوتلیال قرنیه و همچنین پیوند ورق سلول های اپیتلیال رنگدانه ای شبکیه در نمونه های حیوانی هستیم. بایستی از داربست های پلیمری زیست تخریب پذیر در این موارد به دلیل شفافیت نوری که اغلب در بازسازی بافت چشمی مورد نیاز است اجتناب شود.

 

بازسازی پریودنتال

بیماری های پریودنتال در افراد مسّن بسیار شایع است. از آنجا که روش های مرسوم برای دستیابی به بازسازی بالینی کامل و قابل اعتماد برای بافت های پریودنتال کافی نیستند، بیماران از پریودنتیت (التهاب لثه)، هالیتوز (بدبویی دهان) و افتادن دندان ها رنج می برند. براساس شکل زیر، توانسته ایم مهندسی ورق سلول را برای رفع این مشکل اعمال کنیم.

 

شکل 5: پیوند ورق سلولی رباط پریودنتال

 

 

ورق های سلول رباط پریودنتال انسانی که از ظروف کشت پاسخگو حرارتی برداشت شده اند، در موش های صحرایی (که در آن ورق های سلول رد نخواهند شد) به یک حالت تخلیه مزیال (جایی که لثه از جلوی دندان جدا شده است) پیوند داده شد تا بررسی شود که آیا ورق های سلولی می توانند بافت های پریودنتال را بازسازی کنند. طبق شکل زیر در این مطالعه، بافت های شبه رباطی پریودنتال حاوی یک لایه سیمانی مانند سلولی و فیبریل هایی که در این لایه لنگر انداخته اند، شناسایی شدند.

 

شکل 6: بازسازی رباط پریودنتال

 

 

لنگر فیبریل شبیه الیاف رباط پریودنتال محلی است. چنین بازسازی در گروه شاهد غیرپیوندی مشاهده نشد. در نهایت میتوان گفت این نتایج نشان میدهند که این روش میتواند در بازسازی بافت پریودنتال مفید باشد.

 

پیوند مثانه

استفاده از فلپ های دستگاه گوارش در سیتوپلاستی پیوند مثانه عوارض شدیدی ناشی از مخاط دستگاه گوارش در فلپ ها همچون لیتیازیس، عفونت مجاری ادرار و عدم تعادل الکترولیت ها را به دنبال دارد. طبق شکل زیر، یک سیتوپلاستی مدرن برای پیوند مثانه با استفاده از فلپ های دستگاه گوارش و ورق های سلول های ادراری کشت شده را توسعه کرده ایم.

 

شکل 7: پیوند مثانه با ورق های سلولی اوروتلیال

 

 

مخاط دستگاه گوارش در فلپ ها با ورق های سلول ادراری جایگزین میشود که از بیوپسی کوچک اتولوگ و ظروف کشت پاسخگو حرارتی گسترش یافته اند. اکنون ما با یک مدل سگ کار را ادامه می دهیم. ورق های سلول ادراری طیقه بندی شده کشت میشوند و سپس با کاهش دما از این ظروف کاملآ دست نخورده برداشت میشوند. میکروسکوپی الکترون و ایمونوبلاتینگ به خوبی نشان دهندۀ کمپلکس های ریزچاله، میکروویلی و اتصال سلول هستند. سپس ورق های سلول اوروتلیال دست نخورده بر روی فلپ های معده دموکالیزه بطور خودکار پیوند داده میشوند؛ این ورق های سلولی خود به خود، بدون بخیه و ثابت به سطوح بافت دموکالیزه شده کاملآ متصل میشوند. سه هفته پس از این پیوند خودکار، سگ ها تلف شدند و فلپ های معده با ورق های سلول ادراری مورد بررسی قرار گرفت. طبق شکل زیر، بازآفرینی قابل رویش اوروتلیال در توسعۀ اپیتلیوم قابل رویش تلف شده مشابه با اوروتلیوم بومی مشاهده شد.

 

شکل 8: بازسازی اوروتلیال

 

 

همانطور که در این مطالعۀ اورولوژی نشان داده شده است، ورق های سلول برداشت شده از ظروف کشت پاسخگو حرارتی می توانند ابزاری قدرتمند در جراحی ترمیمی باشند. این فناوری جامع در بازسازی های مختلف جراحی مفید واقع میشود.

 

تکه های قلبی

علاوه بر دستکاری ورق سلول دو بعدی، از دستکاری ورق سلول سه بعدی در مهندسی بافت قلب استفاده شده است. پیشرفت های اخیر در درمان پیوند سلول برای ترمیم قلب های ضعیف بدون شک تلاش های بیشتری برای ایجاد بافت قلب سه بعدی مهندس زیستی از میوسیت های قلبی کشت شده را تشویق کرده است. همچنین مهندسی بافت قلبی نیز با استفاده از فناوری متداول با داربست های پلیمری زیست تخریب پذیر بعنوان ECM موقت دنبال شده است. با این حال، انعطاف ناپذیری و خواص حجمی داربست ها بطور قابل توجهی مانع ضربان قلب در میوسیت های قلبی میشوند. براساس شکل زیر، ما توانسته ایم یک روش جدید برای ساخت تکه های قلبی ضربان دار با کمک مهندسی ورق سلول و لایه بندی چندین ورق سلول بصورت سه بعدی ایجاد کنیم.

 

شکل 9: مهندسی ورق سلول در تکه های قلبی

 

 

ورق های میوسیت قلبی در موش صحرایی نوزاد با کاهش دما از ظروف کشت پاسخگو حرارتی جمع شده و سپس برای ساخت پیوندهای قلبی روی هم قرار می گیرند. ورق های سلول لایه ای شروع به پالس همزمان می کنند و ارتباط مورفولوژیکی ازطریق کانکسین 43 بین ورق ها برقرار میشود. .بعد از لایه بندی چهار ورق، سازه مهندسی شده میتواند بصورت خودکار با چشم غیرمسلح ضربان بزند. این تکه های قلبی به بافت های زیرپوستی موش های برهنه پیوند شدند؛ سه هفته پس از پیوند، الکتروگرام های سطحی ناشی از پیوندهای پیوندی شناسایی شده و ضربان های خودکار بصورت ماکروسکوپی مشاهده شد. مطالعات بافت شناسی ساختارهای مشخصی از بافت قلب و نئووسکولاریزاسیون متعدد در بافت های انقباضی را نشان می دهد. بقای طولانی مدت پیوندهای قلبی ضربان دار بیش از یک سال بعد تأیید شده است. این نتایج نشان می دهد که سازه های قلب سه بعدی ضربان دار الکتریکی هم درون تنی و هم برون تنی، با لایه بندی ورق های میوسیت قلبی قابل دستیابی هستند. ما درحال حاضر، با تکه های ورق سلول ساخته شده با میوبلاست اسکلتی اتولوگ در نمونه های حیوانی بزرگ کار می کنیم. مهندسی بافت قلب بر پایه این فناوری ممکن است برای ساخت مدل قلب و ترمیم بافت قلبی مفید باشد.

 

تکنیک های دستکاری ورق سلول که در اینجا تفسیر شده اند، میتوانند در سلول های و ساختارهای بافتی مختلف من جمله لوله ها، کیف ها و توده های جامد کاربرد داشته باشند. ما معتقدیم که دستکاری ورق سلولی دو و سه بعدی، یا همان مهندسی ورق سلولی، بایستی بعنوان یک تکنیک اساسی و عمومی در مهندسی بافت نسل بعدی و پزشکی ترمیمی بکار گرفته شود.