هیدروژل های آلژینات آگار

هیدروژل های آلژینات آگار/ کلسیم چاپ سه بعدی با قابلیت اطمینان بالای شکل و خواص مکانیکی مناسب

در این مطالعه ساختارهای سه بعدی آلژینات کلسیم / آگار (CA/Ag) بعنوان مجموعه های نواری با وضوح بالا و خواص مکانیکی قابل تنظیم با استفاده از روش چاپ سه بعدی حرارتی چاپ شدند. بویژه اینکه، آلژینات و آگار با هم ترکیب شدند تا اثر باروس را کاهش داده و وضوح چاپ را بهبود ببخشند. با ارائۀ آگار خواص رئولوژیکی جوهر همچون افزایش ویسکوزیتۀ آن برای بدست آوردن ساختار چاپ سه بعدی با دقت بالاتر تغییر می کند. زنجیره های آلژینات توسط یون های کلسیم که لایه های مختلفی را به یکدیگر متصل کرده و در سازه های چاپ سه بعدی چسبندگی رابط خوبی بین لایه دارند، به هم پیوند می خورند. علاوه بر این، پس از چاپ اتصال متقابل آلژینات کلسیم بر التهاب و خواص مکانیکی چاپ ژل تأثیر می گذارد. عرض نوارهای ژل اکستروژن که نزدیک به قطر سوزن است، نشان می دهد که با به حداقل رساندن اثر باروس در محلول غلیظ وضوح چاپ به خوبی کنترل می شود.

علاوه براین، ساختارهای ژل چاپ شده که سمیّت سلولی کمتری را نشان می دهند، به این معنا است که این ساختارهای چاپ سه بعدی زیست سازگار جایگزین امیدوارکننده ای برای مهندسی بافت هستند. مهمتر از همه اینکه شبکه پلی اکریل آمید نرم (PAAm) به هیدروژل های چاپ شدۀ سه بعدی CA/Ag برای چقرمگی سطح بین نوارهای مجاور با ترکیب شبکه آلژینات کلسیم سخت و شبکۀ نرم PAAm وارد شد. این هیدروژل های سه بعدی با خواص مکانیکی عالی، سازگاری بالا و وفاداری شکل بالا را میتوان به عنوان یک گزینۀ بالقوه در حوزۀ زیست پزشکی در نظر گرفت.

اخیرآ چاپ سه بعدی به دلیل تولید سریع با وفاداری به شکل بالا در حوزه مهندسی بافت بسیار مورد توجه است. متأسفانه، چاپ های سه بعدی صنعتی با وضوح بسیار بالا از قابلیت های محدودی برای کاربردهای زیست پزشکی برخوردار هستند. امروزه پیشرفت هایی در چاپ سه بعدی زیستی من جمله چاپ سه بعدی (3DP)، مدل سازی رسوب ذوبی (FDM)، استریولیتوگرافی (SLA)، ذوب انتخابی لیزری (SLS) و مستقیم / پلات سه بعدی  عمدتآ بصورت داخلی یا اصلاح ماشین آلات تجاری توسط مهندسان خلاق بدست آمده اند. در مقایسه با سایر روش ها، FDM به دلیل داشتن الگوی تأخیری که برای مهندسی بافت بسیار ضروری است، از خواص مکانیکی خوب و تخلخل بالایی برخوردار است. هیدروژل ها همانند ساختارهای ماتریس خارج سلولی دارای زیست سازگاری خوب و مقدار زیادی آب (حدود 90 درصد) هستند. بنابراین، بطور گسترده بعنوان جذاب ترین ماده در فرایند چاپ بیولوژیک شناخته می شوند. در دهه های گذشته، روش های مختلفی من جمله چاپ جوهرافشان با استفاده از میکرو قطره، چاپ میکرو اکستروژن با استفاده از جوهر مایع مداوم و استریولیتوگرافی با استفاده از فتو پلیمریزاسیون UV پیشنهاد شدند و برای چاپ هیدروژل ها نیز به خوبی توسعه یافتند. در مقایسه با سایر روش ها، چاپ اکستروژن یک فناوری FDM بهبود یافته است که با اکسترود کردن جوهر مایع مداوم یک ساختار لایه ای سه بعدی را ایجاد می کند. از طرفی، این فناوری بهبود یافته را به دلیل تراکم واحد بالا، دامنه زیاد مواد و تعادل مناسب بین هزینه چاپگر و کیفیت چاپ میتوان بعنوان بهترین استراتژی برای چاپ زیستی دانست. با این حال، به دلیل داشتن وضوح پائین در حوزۀ زیست پزشکی محدود است. این مطالعه برای غلبه بر این مشکل، خواص رئولوژیکی جوهر چاپ را تنظیم کرده است تا ساختارهای چاپ سه بعدی را با دقت بالاتری به دست آورد.

پلیمرهای طبیعی همچون کلاژن، اسید هیالورونیک (HA)، کیتوزان و آلژینات پس از چاپ ازطریق اتصال متقابل که معمولآ بعنوان جوهر زیستی استفاده میشوند، میتوانند شکل ساختار سه بعدی را حفظ کنند. اتصال متقابل را نیز میتوان به دو شکل فیزیکی و شیمیایی تقسیم کرد که نوع فیزیکی به دلیل تغییر دما و پیوند عرضی یونی ایجاد میشود؛ در حالی که نوع شیمیایی توسط پلیمریزاسیون ایجاد می شود. سدیم آلژینات (SA) بعنوان یک پلیمر آنیونی میتواند از جلبک های قهوه ای جدا شود و توانایی اتصال متقابل کمکی با دو یا سه ظرفیت را دارد. همچنین SA دارای خواص آبدوستی، زیست سازگاری بالا و تجزیه بیولوژیکی در شرایط طبیعی فیزیولوژیکی است. بعنوان نوعی مادۀ ژل فوری در حوزۀ مهندسی بافت بیشتر مورد توجه است. برای هیدروژل های چاپ سه بعدی به دلیل ویسکوزیتۀ پائین هیدروژل، شکل چاپ اغلب مختل میشود. برای بهبود ویسکوزیتۀ محلول SA، محققان روش های مختلفی همچون تغییر غلظت و وزن مولکولی آن، ترکیب با مواد دیگر من جمله نانوسلولز یا ژلاتین، چاپ با پلیمرهای دارای وفاداری به شکل و پیوند نسبی با یون های کلسیم را پیشنهاد دادند. با این حال، کاهش اثر جوهر زیستی باروس برای دستیابی به وفاداری شکل در زمان چاپ همچنان به درستی مورد بررسی قرار نگرفته است. علاوه براین، بسیاری از هیدروژل های چاپ سه بعدی دارای خواص مکانیکی پائین تر و خواص سطحی ضعیف بین لایه ای هستند. برای بهبود وضوح چاپ و خواص چسبندگی، آگار واکنش پذیر- حرارتی و آلژینات واکنش پذیر یونی برای تهیۀ جوهر مخلوط با هم ترکیب شدند؛ آگار ویسکوزیته جوهر را افزایش میدهد و بنابراین، خواص رئولوژیکی را بیشتر برای چاپ دقیق و مناسب بهبود می بخشد. آلژینات که توسط یون های کلسیم بطور متقاطع پیوند خورده است، لایه های مختلفی را به هم پیوند داده و درنتیجه، رابط خوبی در ساختارهای چاپ سه بعدی ایجاد می شود. با استفاده از جوهر مخلوط آلژینات/ آگار و روش کنترل حرارتی، نوارهای ژل چاپ شدۀ سه بعدی دارای وضوح بالایی هستند و عرض آنها با عرض سوزن مشابه است. پس از چاپ، شبکۀ PAAm به هیدروژل چاپ شدۀ سه بعدی با شبکۀ آلژینات کلسیم سخت وارد میشود تا با استفاده از مکانیسم هیدروژل دو شبکه ای نواقص سطحی را به حداقل برساند. این هیدروژل های سخت سه بعدی با خواص مکانیکی برتر، وضوح چاپ بالا و سمیّت سلولی کم تولید میشوند که به همین دلیل، میتوانند گزینۀ مناسبی برای بافت های مصنوعی در حوزۀ زیست پزشکی محسوب شوند.

مواد

آلژینات سدیم از بیوپلیمر FCM تأمین شده است. آگار، اکریل آمید (AAm)، ان متیلن بیس (اکریل آمید) (MBAA)، سولفات آمونیوم (APS)، تتراماتیل اتیلن دی آمین (TEMED) و کلراید کلسیم از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شده اند.

سیستم چاپ سه بعدی

همانطور که در بخش اول از طرح یک نشان داده شده است، از چاپگر سه بعدی لیپفراگ اصلاح شده برای چاپ ژل استفاده شده است. یک پمپ تزریق برای کنترل سرعت اکستروژن جوهر با دامنۀ تزریق 0.73 تا 2100 میلی لیتر در ساعت بر روی پلتفرم سیار نصب شد. علاوه براین، برای کنترل دمای چاپ از یک کنترل کنندۀ حرارتی با پد حرارتی سرنگ نیز استفاده شد. برای بدست آوردن جوهر چاپ مداوم، از سوزن های نوک تیز (14 تا 26 سنج) برای تزریق استفاده شد. جی کد نیز توسط نرم افزار تجاری سه بعدی برای کنترل فرایند چاپ تولید شده است. همانطور که در بخش دوم از همین طرح نشان داده شده است، در این فرایند، مخلوط آگار واکنش پذیر- حرارتی و آلژینات واکنش پذیر یونی به نوارهای مداوم اکسترود میشوند تا اثر باروس را به حداقل رسانده و وضوح چاپ را بهبود ببخشند. بطور همزمان، افزایش ویسکوزیته مخلوط موجود در فرایند چاپ را قادر می سازد تا شکل خود را حفظ کند و اندازۀ نوار چاپ شده نیز نزدیک به قطر داخلی نازل بود. درنهایت، براساس بخش سوم از همین طرح، SA پس از چاپ توسط یون های کلسیم به هم پیوند خوده و باعث بهبود چسبندگی رابط بین لایه ها میشود.

طرح 1: الف: دیاگرام ماشین چاپ سه بعدی؛ ب: نازل چاپ و ج: فرایند چاپ

ساخت هیدروژل های سخت با قابلیت چاپ سه بعدی

برای دستیابی به هیدروژل های سخت با قابلیت چاپ سه بعدی از یک روش دو مرحله ای جدید استفاده شد. ابتدا جوهر مخلوط (200 میلی گرم از SA و Ag) آماده شد؛ SA در 10 میلی لیتر آب حل شده و یک شب بطور مداوم هم زده میشود. سپس در حمام روغن تا 95 درجه سانتیگراد گرم شده و 200 میلی گرم آگار به آن افزوده میشود. پس از حل شدن کامل آگار در آب، جوهر مخلوط شده قبل از چاپ در دمای 65 درجه سانتیگراد سرد میشود. در طی فرایند چاپ، از پد گرم کننده سرنگ برای حفظ دمای چاپ تا 55 درجه سانتیگراد استفاده میشود. پس از چاپ، 30 میلی گرم از این محلول برای پیوند عرضی SA به منظور ایجاد پیوند قوی بین خطوط و لایه ها استفاده میشود. ترکیب 200 میلی گرمی از SA و Ag نشان میدهد که غلظت آگار و آلژینات هرکدام 20 میلی گرم بر میلی لیتر است. برای تولید هیدروژل های دوشبکه ای سفت، شبکۀ PAAm نرم به ساختارهای چاپ شدۀ سه بعدی کلسیم و آلژینات وارد شد. بطور خلاصه میتوان گفت که هیدروژل های چاپ سه بعدی به مدت 24 ساعت در محلول 40 میلی لیتری با 6000 میلی گرم AAm، 12 میلی گرم MBAA و 60 میلی گرم APS خوابانده میشود. سپس 20 میکرولیتر از TEMED برای پلیمریزاسیون 12 ساعته افزوده شد. پس از آن، ژل های شبکۀ منفرد (PAAm) نرم (SN) از نمونه های چاپ شدۀ سخت حذف شد.

خواص

هر نمونه برای اندازه گیری به سه بخش تقسیم شده و خواص مکانیکی نیز با استفاده از دستگاه تست کشش جهانی محاسبه شد. سرعت تلاقی در اندازه گیری کشش 10 میلیمتر در کمتر از یک دقیقه بود. مدول الاستیک (E) نیز از تنش فشار 0 تا 10 درصد محاسبه شد؛ تنش عها نیز با میزان نیرو (ضخامت بر طول) محاسبه شدند. برای تحلیل خواص رئولوژیکی محلول SA با ترکیب متفاوت در 25 درجه سانتیگراد از یک رئومتر کنترل شده با استرس AR-G2 با هندسه استوانه ای دو شکاف (1 میلی لیتر) استفاده شد. در همین حال، ویسکوزیتۀ جوهر ترکیبی با دمای متفاوت از 35 تا 65 درجه سانتیگراد تعیین شد. نرخ برش نیز از 01/0 تا 1000 متغیر بود.

سمیّت سلولی

سمیّت سلولی در ژل های چاپ شده با تریپان آبی ارزیابی شد. ابتدا ژل ها به مدت سه روز در اسیدهای آمینۀ غیرضروری ایگل (EMEM) قرار داده میشوند تا باقیمانده ها قبل از کشت از بین بروند و سپس ژلها تا سه روز دیگر در همین محیط می مانند تا محیط کشت سلول فراهم شود. 10E5 از سلول های U87-MG به پالت شش تایی منتقل شده و در محیط کشت مشروط به مدت 48 تا 72 ساعت باقی می مانند؛ در حالیکه گروه کنترل در محیط کشت تازه کشت میشوند. پس از آن، 1 میلی لیتر نمک بافر فسفات دالبکو (DPBS) برای شستشوی سلول های چسبنده اضافه شد. در ادامه، 1 میلی لیتر تریپسین برای جایگزینی نمک بافر استفاده شد و پالت شش تایی در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و غلظت دی اکسید کربن 5 درصدی به مدت 2 دقیقه انکوبه شد تا سلول ها از صفحه کشت جدا شوند. 100 میکرولیتر FBS برای جلوگیری از جدا شدن به پالت افزوده شد. درنهایت، 20 میکرولیتر تریپان آبی نیز به 20 میکرولیتر سوسپانسیون سلول افزوده شد و به خوبی تکان داده شد تا مخلوط شود. 20 میکرولیتر از این مخلوط در محفظۀ شمارش یکبار مصرف قرار داده شد که در سیتومتری تصویر با سلومتربرای شمارش و تصویربرداری قرار گرفت.

در این مقاله، سازه های هیدروژل آلژینات کلسیم / آگار با وفاداری شکل بالا و وضوح چاپ توسط فناوری چاپ سه بعدی تولید شده است. و سپس شبکۀ PAAm نرم برای دستیابی به هیدروژل های سخت چاپ شدۀ سه بعدی با هیدروژل های چاپ سه بعدی CA/Ag مورد استفاده قرار گرفت. خواص رئولوژیکی جوهرهای مختلف بطور کامل مورد بررسی قرار گرفته و مشخص شد که افزودن آگار ویسکوزیتۀ جوهر را بسیار بهبود بخشیده و وضوح بالای چاپ را تضمین می کند. با کنترل دما و حذف اثر باروس، پیش ژل با دقت بالایی چاپ شد. از آنجا که ساختارهای چاپ سه بعدی از نوارهای پیچیده تشکیل شده اند، چسبندگی سطحی برای خواص مکانیکی بسیار مهم است. پس از خیساندن در محلول کلراید کلسیم، آلژینات در نوارهای مجاور توسط یون های کلسیم پیوند می خورد تا نواقص سطحی در بین نوارها را به حداقل برساند. اینگونه ساختارها زیست سازگاری بالا، نفوذپذیری بالا و وفاداری به شکل را نشان داد که پتانسیل استفاده در چاپ زیستی سه بعدی را دارد. با ورود PAAm به هیدروژل های چاپ شدۀ سه بعدی، رابط های بین نوارها با ترکیب شبکۀ PAAm نرم و شبکۀ آلژینات کلسیم سخت سفت شدند. این هیدروژل های سخت چاپ شدۀ سه بعدی دارای خواص مکانیکی عالی و وفاداری به شکل بالایی هستند و میتوانند بعنوان گزینۀ مناسبی برای کاربردهای حوزۀ زیست پزشکی مطرح شوند. علاوه بر این، خواص مکانیکی آنها با ترکیبات مختلف بطور سیستماتیک بررسی شده است.